UHPLCQTOFMS整合网络药
来源：《中国中药杂志》网络首发日期：-09-18
UHPLC-Q-TOF-MS整合网络药理学
研究升陷汤有效成分及其治疗
慢性心力衰竭的作用机制
马颖1,2，王博龙2，王亮3，黄翠云1，
孙美3，焦广洋1，张凤1，陈万生1,3
（1.医院药学部；2.宜春学院化学与生物工程学院；3.上海中医药大学中药研究所）
慢性心力衰竭（chronicheartfailure，CHF）是指任何原因导致心脏结构改变或心肌受损，使心肌收缩功能明显减弱，心脏泵血功能降低而引起的复杂临床综合征，是各种心血管疾病的终末阶段，其较高的发病率和致死率引起世界各国高度重视，已成为我国心血管领域的重要公共卫生问题。目前临床治疗CHF的“金三角”有β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）/血管紧张素受体（ARB）和醛固酮受体拮抗剂，均有一定的不良反应。心衰患者平均每天会使用至少6种处方药物，使得药物不良反应叠加反而造成心衰加重。中药在该疾病的治疗方面具有安全可靠、副作用小、疗效持久的优势。升陷汤为治疗大气下陷证的代表方，出自张锡纯先生所著《医学衷中参西录》，由黄芪、升麻、柴胡、知母和桔梗组成。中医名家曹洪欣教授、张明雪教授等运用升陷汤治疗心力衰竭效果良好，但其具体药效物质及作用机制并不清楚。
中药血清药物化学是以传统药物化学方法为基础，综合应用多种现代技术，分析鉴定口服中药后血清中移行成分，研究其与药效相关性，确定中药药效物质基础的应用学科，已成为快速确定复方药效物质的有效途径之一。UHPLC-Q-TOF-MS由于灵敏度高、扫描范围广的特点，已成为研究血清药物化学的首选方法。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术分析升陷汤血中移行成分，通过比较分析升陷汤提取物、给药后含药血清及升陷汤混合对照品血清成分，识别得18个原型入血成分，同时应用网络药理学方法与技术，结合成分、蛋白、基因等数据库，采用生物信息学等手段构建和分析多元生物网络，运用可视化分析软件探究升陷汤入血成分作用靶点，以及基因本体分析和通路富集等，尝试从宏观角度系统阐述升陷汤入血成分治疗慢性心力衰竭的科学内涵，为其临床应用提供参考证据。
1材料Agilent-超高效液相-飞行时间质谱仪（UHPLC-Q-TOF-MS，Agilent公司，美国）；CPAD型1/10万电子天平（Sartorius公司，德国）；LyovaporL-冷冻干燥机（BUCHI公司，瑞士）；Eppendorfminispin离心机（Eppendorf公司，德国）；Eppendorfr离心机（Eppendorf公司，德国）；SK7H型超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；Milli-Q型纯化水系统（Millipore，美国）。
黄芪（批号，内蒙古）、知母（批号，河北）、升麻（批号，吉林）、柴胡（批号，山西）和桔梗（批号，安徽）药材均购自吴江上海蔡同德堂中药饮片有限公司。毛蕊异黄酮（MB）、升麻素苷（MB）、芦丁（MB）、黄芪甲苷（MB）、阿魏酸（MB）、异阿魏酸（MB）、芒柄花素（MB）、槲皮素（MB）、芒果苷（MB）、芒柄花苷（MB）、毛蕊异黄酮苷（MB）、新芒果苷（MB）、知母皂苷（MB）、知母皂苷BII（MB）和桔梗皂苷D（MB）购自大连美仑生物技术有限公司，纯度均≥98%；柴胡皂苷A（MB，纯度90.5%）和柴胡皂苷D（MB，纯度94.6%）购自大连美仑生物技术有限公司；咖啡酸（C-2G，纯度≥98%）购自LifeScience公司。
2方法2.1供试品溶液的制备
与本课题组前期实验同法制备升陷汤供试品，升陷汤组方饮片（黄芪g，知母g，柴胡g，桔梗g和升麻g），乙醇提取、D大孔吸附树脂处理后，得g干燥提取物（得率3.8%），于?20℃冰箱中保存备用。
取各对照品约1.0mg，精密称定并置于1mL量瓶中，加入甲醇并稀释至刻度，摇匀制备成0.1mg?mL-1的单一对照品储备液；分别量取上述储备液适量，混合后加入纯甲醇稀释，最终制备成各对照品质量浓度均为1μg?mL-1的混合对照品溶液。
2.2血清样本的制备
将SD大鼠随机分为2组，即空白组和给药组。禁食12h，但自由饮水。给药组大鼠灌胃给予升陷汤提取物mg?kg-1，相当于生药量70.6g?kg-1。空白组大鼠给予等体积的CMC-Na混悬液。于给药30，60min和2h后股动脉采集全血2mL，在4℃条件下静置30min后，以0r?min-1的转速离心10min，取上层溶液于1.5mL离心管中。将同一组各血清混合后，置于-20℃冰箱保存，备用。
取给药血清50L，加入L含0.1%甲酸的甲醇溶液，涡旋混匀3min后，r?min-1转速离心10min，取上清液L于棕色进样小瓶中，待UHPLC-Q-TOF-MS分析；取50L的混合标准溶液，加入L的大鼠空白血清，制成升陷汤对照品混合添加血清，涡旋混匀3min后，r?min-1转速离心10min，取上清液L于棕色进样小瓶中，待UHPLC-Q-TOF-MS分析。
2.3色谱条件
WatersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱（2.1mm×mm，1.7m）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱(0～2min，10%～35%B；2～15min，35%～95%B；15～17min，95%～95%B)；后运行时间3min；体积流量0.35mL?min-1；柱温35℃，进样体积5L。
2.4质谱条件
电喷雾离子源，扫描方式为正、负离子扫描（m/z～），毛细管电压4.5kV，锥孔电压V，离子源温度℃，雾化气（N2）压力45psi(1psi≈6.kPa)，温度℃，干燥气流速11L?min-1，鞘气流速11L?min-1，鞘气温度℃。
2.5数据分析方法
利用Masshunter软件通过对比给药后血清和空白血清的质谱图，扣除血清中的内源性成分，将剩余离子峰与体外药材提取液离子峰的保留时间和质荷比进行对比，如果一致则确认为升陷汤中的原型成分。通过18个化合物混合对照品溶液质谱图与含药血清进行对比，按化学式查找（findbyformula）功能，根据精确质量、同位素丰度，以及上述分子离子峰进行鉴定，确认18个原型成分在血清中的保留特征。
2.6入血成分靶点、抗慢性心力衰竭靶点的筛选及关联网络构建
运用SwissTargetPrediction和TCMSP数据库搜索入血成分靶点，以“chroniccardiacfailure”“chronicheartfailure”为关键词，在DisGeNET，GeneCards，OpenTargetsPlatform，TTD数据库中收集汇总慢性心力衰竭相关靶点，将其与升陷汤入血成分靶基因输入Venny2.1软件，筛得二者交集靶基因作为升陷汤治疗慢性心力衰竭的潜在靶基因；最后利用Cytoscape3.6.1软件构建“药物-入血成分-靶点网络”。
2.7PPI网络的构建和核心靶点的筛选
为研究靶点之间的相互作用，将筛选出的潜在靶点导入STRING网络平台，设置蛋白种类为“Homosapiens”，最低相互作用阈值为“mediumconfidence”，其余参数均保持默认值，结果保存为TSV格式并导入Cytoscape3.6.1软件；运用其插件“NetworkAnalyze”分析网络拓扑参数，以节点度值（Degree）、介数（Betweenness）、最短路径（Clossness）均超过平均值为标准筛选出关键靶点。
2.8关键靶点基因本体GO分析和KEGG信号通路富集
运用OmicShare云平台对关键靶点进行动态GO富集分析，利用平台候选背景基因，选择“Homosapiens（智人）”，其中GO功能分析包括生物过程（biologicalprocess）、分子功能（molecularfunction）和细胞组成（cellular